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    兔主動脈平滑肌細胞培養(yǎng)血管壁可分為內(nèi)膜、中膜與外膜三層。內(nèi)膜由內(nèi)皮、內(nèi)皮下層和內(nèi)彈性膜組成；中膜由平滑肌、彈性纖維和膠原纖維組成；外膜為結(jié)締組織，與周圍的結(jié)締組織相連。除去血管內(nèi)膜和外膜后，即為血管平滑肌細胞層。體外培養(yǎng)可使平滑肌細胞持續(xù)存活與生長，并保持血管平滑肌細胞在體的某些特性，便于研究。本節(jié)以兔主動脈平滑肌細胞為例介紹培養(yǎng)法。

一、材料與試劑

(一)材料

動物家兔(大鼠、豬等動物亦可)。

(二)培養(yǎng)液與試劑

1．MEM培養(yǎng)液添加水解乳蛋白、、小牛血清(原代培養(yǎng)時加20％，傳代培養(yǎng)時加10％)，(100IU／ml)和(100μg／ml)，以NaHCO3溶液調(diào)pH至7．2。

2．Hanks液

3．消化液0．15％；0．2％膠原酶；0．15％胰蛋白與O．020%EDTA等量混合液。

4．培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及手術(shù)器具等。

二、培養(yǎng)方法

(一)動脈血管壁中膜的制備

1．將家兔乙醚麻醉后固定，乙醇消毒胸腹部，沿胸骨切開胸腔，找到主動脈，兩端結(jié)扎，無菌切下主動脈血管．放入含有Hanks液的平皿中。

2．將取下的血管用Hanks液反復(fù)洗凈血污后放人含培養(yǎng)液平皿中。

3．將洗凈動脈切成2．5～3．0cm長的小段并剝離外膜。用兩個鑷子在動脈段的一端撕開外膜，用組織鑷夾住中膜，用帶鉤鑷子夾住外膜向另一端撕拉，使外膜呈現(xiàn)套袖狀剝下。

4．剪取鑷子夾過的中膜，將動脈縱行剪開，使內(nèi)膜朝上平攤于小木塊上，以圓鈍的鑷子或剪刀背輕輕刮去內(nèi)皮細胞。

5．將剝?nèi)?nèi)、外膜的中膜在培養(yǎng)液中洗凈，平鋪在另一小木塊上，用刀片切成1mm3大小的組織塊，即為平滑肌組織。

(二)分散細胞與原代培養(yǎng)

1．將動脈中層組織塊置于小三角燒瓶(或小瓶)中，加入O．2％膠原酶溶液，蓋上蓋，在37℃恒溫箱中作用1～3h，至組織呈絮狀。

2．再加入O．15％溶液，于37℃磁力攪拌下消化5～10min。吸取分散的細胞，即為平滑肌細胞。如還有組織塊，可用溶液再消化1次。

3．將所得的全部細胞懸液吸入刻度離心管中，加含10％小牛血清的培養(yǎng)液以終止消化。1000～1500r／min離心5min，棄去上清液。

4．將細胞沉淀加入含20％小牛血清的培養(yǎng)液中，調(diào)制成濃度為l～5×105個／ml的細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中。

5．37℃、C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察，每3d換液1次。

(三)傳代細胞培養(yǎng)

    當(dāng)原代細胞生長至融合并形成單層細胞時即可傳代培養(yǎng)。

1．傾去培養(yǎng)液，以Hanks液洗滌瓶壁上的細胞2次。

2．加入O．15％與0．02％EDTA混合消化液，覆蓋細胞表面即可。室溫下作用2min并用倒置(或相差)顯微鏡觀察，可見大部分細胞變圓，邊緣清楚，此時翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶停止消化。

3．倒去消化液，加入含10%小牛血清的培養(yǎng)液以終止消化。用吸管吹打(或用帶膠皮的彎頭滴管將細胞從瓶壁上刮下再吹打)分散細胞，制成細胞懸液。調(diào)制細胞濃度為l～5×105個／ml。

4．接種到新的培養(yǎng)瓶中，并補充含10％小牛血清的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。細胞長滿成層后，又可依同法傳代。

(四)細胞同步培養(yǎng)法

    當(dāng)常規(guī)培養(yǎng)的平滑肌細胞轉(zhuǎn)入低血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)2～3d后，細胞大多能停留在細胞周期的G0期，基本達到同步化效果。具體方法：

1．傾去常規(guī)培養(yǎng)的培養(yǎng)液，并用Hanks液洗滌3次。

2．加入含O．5％小牛血清的培養(yǎng)液，于37℃下維持培養(yǎng)2～3d，可使細胞基本上同步于G0期。

3．當(dāng)轉(zhuǎn)入含10％血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)12h時，平滑肌細胞會再次同步進入DNA合成期。

(五)平滑肌細胞玻片培養(yǎng)法

    將小方瓶(或培養(yǎng)皿)內(nèi)預(yù)先放人蓋玻片，將平滑肌細胞懸液接種其上，待生長成單層細胞后取出蓋玻片，用于染色、制電鏡標本等。

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