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細胞感染有以下三種:
(一)細胞準備
將狀態(tài)良好的目的細胞接種到24孔板,使細胞濃度為 1×105/ml 細胞,接種細胞數(shù)量因細胞的生長速度而略有不同, 一般是保證第二天進行病毒感染的時候細胞匯合率介于 50%至70%之間。
(二)病毒感染
1.感染細胞MOI 的測定MOI(Multiplicity of Infection,感染復數(shù))是指每個細胞感染的病毒數(shù),通常MOI 越高,病毒整合到染色體的數(shù)量以及目的蛋白的表達量越高。對于分裂活躍的細胞,比如 Hela、293 細胞,MOI=1~3 時,80%以上的細胞均表達目的基因。而對于非分裂細胞,比如原代細胞,感染效率較低。需要進行MOI梯度摸索實驗,選擇適合的MOI 進行實驗。
2.感染步驟
按實驗需要將細胞鋪板(比如12孔板);細胞數(shù)以第2天密度約50%為宜;37℃ 培養(yǎng)過夜。
對于Polybrene 可施加的細胞:準備*培養(yǎng)基和 Polybrene混合物,Polybrene 終濃度為摸索得到的zui適終濃度。移去培養(yǎng)基并添加 0.5 ml Polybrene/培養(yǎng)基混合物于每孔中(適用于24 孔板,其他孔板請相應調整體)。
對于不適用 Polybrene 的細胞,以上步驟省略,直接進入下面步驟:
感染前,從冰箱取出并在 37℃水浴中快速融化病毒,吸去細胞原有培養(yǎng)基,將病毒原液加入細胞中,輕輕8字混勻。感染后第二天(約12小時),吸去含病毒的培養(yǎng)液,換上新鮮的*培養(yǎng)液,繼續(xù)37℃培養(yǎng)。感染后48小時,對于帶 GFP報告基因的病毒,可通過熒光顯微鏡觀測GFP表達效率,對于攜帶 Puromycin抗性基因的病毒,換上含適當濃度的 Puromycin 的新鮮*培養(yǎng)液,篩選穩(wěn)定轉導的細胞株。