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VE Elisa Kit斑點免疫金銀染色法實驗原理
VE Elisa Kit試劑及材料
1. NC膜
2. 20mol/L,pH7.6 PBS
3. BSA
4. 定影液:20%。
5. 電泳儀和電轉(zhuǎn)儀
6. 其它試劑同上
操作方法
1. 用微量加樣器在NC膜上直接點樣1-2ml(若抗原含量少,可重復(fù)點樣),或經(jīng)轉(zhuǎn)移電泳將抗原吸附在NC膜上,自然干燥;
2. 將點樣后的NC膜浸入含5%BSA和0.05% NaN3的20mol/L,pH7.6 PBS內(nèi),37℃,30min,以封閉未飽和的蛋白質(zhì)結(jié)合位點;
3. 用含0.1%BSA的TBS洗三次,每次5min;滴加適當(dāng)稀釋的一抗(1-2mg/ml,VE Elisa Kit用含0.1%BSA和正常羊或兔血清的TBS稀釋),陰性對照用稀釋液代替抗體,在室溫下,反應(yīng)2h;
4. 用含0.1%BSA的TBS洗三次,每次5min后,將NC膜浸入金標(biāo)二抗溶液中(金標(biāo)抗體用含0.4%明膠和0.1%BSA的TBS適當(dāng)稀釋)。反應(yīng)時間視金標(biāo)抗體的稀釋度而定:一般1:25稀釋(OD520 nm值約為0.2),反應(yīng)時間為2h;1:100-1:200稀釋(OD520 nm值約為0.005),反應(yīng)時間為16h;
5. TBS沖洗,即可觀察結(jié)果。此過程為dot-IGS。
6. 需要是可繼續(xù)進(jìn)行銀顯色反應(yīng),行dot-IGSS:將金標(biāo)抗體染色后的NC膜,用TBS洗三次,每次5min,再用蒸餾水洗滌兩次以去除Cl- ,浸入0.2mol/L,pH3.5枸櫞酸緩沖液內(nèi)2min;
7. 移入銀顯色液中,避光顯色5-10min后,再移入定影液中,定影5min;
8. 自來水沖洗,自然干燥;
結(jié)果觀察
dot-IGS:VE Elisa Kit在NC膜上呈粉紅色;dot-IGSS:在NC膜上呈棕黑色。
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