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實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大?。?/span>

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細(xì)胞簡介：

兔視網(wǎng)膜血管周分離自視網(wǎng)膜微血管組織；周細(xì)胞（pericyte）又稱Rouget細(xì)胞和壁細(xì)胞，是一種包圍全身毛細(xì)血管和靜脈中內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞，可以收縮。周細(xì)胞嵌入毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基膜中，通過物理接觸和旁分泌信號(hào)與內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞通訊，監(jiān)視和穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞的成熟過程。此外，周細(xì)胞還具有調(diào)控毛細(xì)血管血流量、細(xì)胞碎屑清除和吞噬以及血腦屏障滲透性的作用，其多功能性是目前研究的熱點(diǎn)之一，所以對(duì)血管周細(xì)胞的生物學(xué)特征、標(biāo)記物、細(xì)胞功能等的研究都為相關(guān)研究提供基礎(chǔ)資料。周細(xì)胞產(chǎn)生手指狀的外延以調(diào)控毛細(xì)血管的血流量。周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間共同擁有一個(gè)基膜，基膜上有多種細(xì)胞連接，包括多種整合素、神經(jīng)鈣黏素、纖連蛋白以及接合素。它還參與毛細(xì)血管直徑的雙向調(diào)控；毛細(xì)血管受損時(shí)，周細(xì)胞還可增殖，分化為內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。

方法簡介：

實(shí)驗(yàn)室分離的兔視網(wǎng)膜血管周采用膠原酶-聯(lián)合消化法及不銹鋼網(wǎng)篩過濾法制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)室分離的兔視網(wǎng)膜微血管周經(jīng)α-SMA免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：成纖維細(xì)胞樣

傳代特性：可傳3代左右

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔視網(wǎng)膜微血管周體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

注意事項(xiàng)：

1. 收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系。

2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問題，責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。

3. 用75%酒精擦拭細(xì)胞瓶表面，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。因運(yùn)輸問題，部分細(xì)胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正常現(xiàn)象。觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細(xì)胞可以消化，懸浮細(xì)胞直接混勻收集細(xì)胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細(xì)胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5. 請(qǐng)客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運(yùn)輸?shù)脑?，個(gè)別敏感細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系，告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細(xì)胞僅供科研使用。

8. 備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)T25瓶或者2個(gè)6cm皿。不是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

大鼠/離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶β4肽(ATP1β4)檢測(cè)試劑盒 ，英文名： ATP1β4 ELISA Kit

Monkey apoprotein B100 (apo-B100) ELISA Kit 猴載脂蛋白B100(apo-B100)檢測(cè)試劑盒

RatE-SelectinELISAkit 大鼠E選擇素(E-Selectin/CD62E)檢測(cè)試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

CLIAKitforGHRPELISAKit大鼠生長激素釋放多肽

細(xì)胞鈣調(diào)神經(jīng)0酸酶(CALCINEURIN;PP2B)活性定0比色法定量檢測(cè)試劑盒20次

Ratsolubleierleukin-1receptorⅡ,IL-1sRⅡELISAKit大鼠白介素1可溶性受體Ⅱ(IL-1sRⅡ)檢測(cè)試劑盒規(guī)格：96T/48T

TNFRSF11B重組食蟹猴 Osteoprotegerin / TNFRSF11B 蛋白 (Fc 標(biāo)簽) Protein

Mcl-1(myeloid cell leukemia 1 0.5mgMcl-1(myeloid cell leukemia 1) peptide 髓樣細(xì)胞白血病-1抗原

KIT重組人 c-KIT / CD117 蛋白 Protein

IL11 Protein Human 重組人 IL11 / Interleukin 11 / IL-11 蛋白

CDCP1 Protein Mouse 重組小鼠 CDCP1 蛋白

Mcl-1(myeloid cell leukemia 1 0.5mgMcl-1(myeloid cell leukemia 1) peptide 髓樣細(xì)胞白血病-1抗原

IL11 Protein Human 重組人 IL11 / Interleukin 11 / IL-11 蛋白

TNFRSF11B重組食蟹猴 Osteoprotegerin / TNFRSF11B 蛋白 (Fc 標(biāo)簽) Protein

CDCP1 Protein Mouse 重組小鼠 CDCP1 蛋白

KIT重組人 c-KIT / CD117 蛋白 Protein

豚鼠纖溶酶抗纖溶酶復(fù)合物(PAP)檢測(cè)試劑盒 ，英文名： PAP ELISA Kit

Two human protein disulfide isomerase (PDI) ELISA Kit 人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)檢測(cè)試劑盒

MonkeyVascuoarendothelialcellgrowthfactorreceptor,VEGFR-3ELISAkit血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-3(VEGFR-3)檢測(cè)試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

CLIAKitforBMG/Beta2-MGELISAKit大鼠β2微球蛋白

細(xì)菌內(nèi)生孢子(ENDOSPORE)染色試劑盒50次

RabbitmajorhistocompatibilitycomplexⅠ,MHCⅠ/RLAⅠELISAKit兔主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類(MHCⅠ/RLAⅠ)檢測(cè)試劑盒規(guī)格：96T/48T

兔視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞生長因子   英文名稱：   Human Growth Factor   規(guī)格：      英文縮寫：   GF

生長激素釋放多肽   英文名稱：   Human Growth Hormone Releasing Peptide   規(guī)格：      英文縮寫：   GHRP

生長激素   英文名稱：   Human Growth Hormone   規(guī)格：      英文縮寫：   GH

人三0酸鳥苷環(huán)水解酶1   英文名稱：   Human Guanosine 5′-iphosphate Cyclohydrolase 1   規(guī)格：      英文縮寫：   GCH1