ELISA 是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術。免疫酶技術是將酶標記在抗體/抗原分子上，形成酶標抗體/酶標抗原，稱為酶結(jié)合物。該酶結(jié)合物的酶在免疫反應后，作用于底物使之呈色，根據(jù)顏色的有無和深淺，定位或定量抗原/抗體。ELISA 法是免疫酶技術的一種，其特點是利用聚苯乙烯微量反應板(或球)吸附抗原/抗體，使之固相化，免疫反應和酶促反應都在其中進行。在每次反應后都要反復洗滌，這既保證了反應的定量關系，也避免了末反應的游離抗體/抗原的分離步驟。在ELISA 法中.酶促反應只進行一次，而抗原、抗體的免疫反應可進行一次或數(shù)次，即可用二抗(抗抗體)、三抗再次進行免疫反應。
目前常用的幾種ELISA 方法有：測定抗體的間接法，測定抗原的雙抗體夾心法和測定抗原的競爭法等。本實驗采用間接法測定單克隆抗體效價。其主要過程為：首先將已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反應板的凹孔內(nèi)，加待測抗體，保溫后洗滌以除去未結(jié)合的雜蛋白質(zhì)，加酶標抗抗體，保溫后洗滌，加底物保溫30分鐘后，加酸或堿終止酶促反應，用目測或光電比色測定抗體含量。
儀器、原料和試劑
儀器
聚苯乙烯96孔酶標板、微量移液管、酶聯(lián)免疫閱讀儀、水浴鍋。
原料
單克隆抗體
試劑
1. 抗原及酶標記抗體
①抗原：兔抗人IgG(Rabbit Aanti-human IgG，Code No.A0423);
②酶標抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP(Rabbit Anti-mouse IgG-HRP，Code No.P0260);均為
DAKO 公司產(chǎn)品，使用時按照說明書要求稀釋。
4. 洗滌液(含0.05%Tween 20的PBS)：1LPBS 中加入Tween-20 500μL。
5. 封閉液(含1%牛血清白蛋白，0.1%Tween 20的PBS)：10mLPBS 中加入100mgBSA，10μLTween-20。
6. 底物溶液
①緩沖液(0.1mol/LpH6.0)：稱Na2HPO4·12H2O2.2g，NaH2PO4·2H2O 6.84g，用蒸餾水溶解，定容至500mL。
② TMB 貯液：稱60mgTMB 溶于10mL 二甲基亞砜中，4℃避光保存。
③底物應用液：現(xiàn)用現(xiàn)配，磷酸鈉緩沖液10mL，TNB 貯液10μL。30%H2O2 15μL，混勻。
7. 終止液：2mol/LH2SO4
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